Uso simultâneo do método do polimorfismo conformacional de fita simples e da citometria de fluxo no aumento da eficácia da detecção de anormalidades do gene e da proteína p53 na leucemia mielóide crônica / Simultaneous use of the single strand conformation polymorphism method and flow cytometry for increasing the detection efficacy of abnormalities in the gene and p53 protein in chronic myeloid leukemia

A proteína p53 desempenha um importante papel no controle do ciclo de celular e reparo no DNA danificado. Em pacientes com leucemia de mielóide crônica (LMC) as mutações neste gene são encontradas em até 30% dos casos, especialmente na crise blástica (LMC-CB), sendo a detecção de alterações nesse gene ou proteína importantes na avaliação da evolução clínica da LMC. O sequenciamento de DNA é descrito como o método capaz de identificar as mutações do gene TP53, sendo, no entanto uma técnica complexa e dispendiosa, o que dificulta seu emprego em larga escala, sendo, atualmente, proposto a pesquisa da proteína p53 por métodos imunológicos e a técnica da reação em cadeia da polimerase seguida pelo estudo do polimorfismo conformacional de fita simples (PCR/SSCP). Métodos: Analisaram-se amostras de 72 pacientes com LMC: 54 de LMC em fase crônica (33 fase inicial ou LMC-FCi e 21 em fase crônica tardia ou LMC-FCtd), 7 em fase acelerada ou LMC-Ac e 11 em crise de blástica (LMC-CB). Foram realizados PCR para os exons 5-9 para posterior estudo pelo SSCP e a expressão de proteína de p53 foi feita por citometria de fluxo. Resultados: Na análise do PCR-SSCP, alterações de mobilidade eletroforética indicativa de mutação do gene de TP53 foi observado em 11/72 pacientes e a expressão da proteína p53 em 17/72 pacientes. O SSCP anormal foi visto em dois casos de LMC-FCi (exon 7), quatro LMC-FCt (um exon 7, um exon 8 e dois exons 8-9), um na LMC-FAc (exon 8) e quatro na LMC-CB (dois no exon 5, um no exon 6 e um no exon 8-9). Neste grupo, a proteína de p53 estava expressa sete casos (todas LMC-CB e AC e 2 LMC-FCtd), havendo correlação estatisticamente significativa entre os resultados dos dois métodos. Conclusões: Estes resultados sugerem que os dois métodos conjuntamente empregados podem aumentar a sensibilidade na detecção de anormalidades do gene e proteína p53 nos pacientes com LMC. A presença de SSCP anormal associado à expressão da proteína de p53 nas fases avançadas desta doença na maioria de casos, sugere que estes exames possam se empregados como indicadores de progressão para a LMC.

The p53 protein play an important role in the control of the cell cycle and DNA repair. In patients with chronic myeloid leukemia (CML) mutation in this gene were found in up to 30%, especially among those in blast crisis. At present, the only widely available technology that reliable detects and defines all mutations is DNA sequencing. However, the routine sequencing of the entire TP53 gene in all cases suggestive of mutation in the laboratorial routine is prohibitively costly, complex, and time consuming. To screen for TP53 abnormalities in CML patients, both p53 protein expression bay immunologic methods and single strand conformation polymorphism of polymerase chain reaction products (SSCP-PCR) is proposed. Methods: We report the results of an analysis of 72 samples from CML patients:54 in chronic phase :33 in initial phase (ICP-CML) and 21 in late phase (LCP-CML), 7 in accelerated phase (AP-CML) and 11in blast crisis (BC-CML). DNA structure for 5-9 exons of the TP53 gene were analyzed by PCR-SSCP and p53 protein expression by flow cytometry (CF). Results: By PCR-SSCP analysis, shifts in eletrophoretic mobility of the TP53 gene were detected in 11 out of CML patients and p53 protein expression in 17 out of 72 CML patients. The abnormal SSCP pattern were showed in two cases of ICP-CML (exon 7), four LCP-CML (one exon 7 and exon 8 and two exons 8-9), one in AP-CML (exon 8) and four in BC-CML (two in exon 5, one in exon 6 and one in exon 8-9). In this group, the p53 protein were express in 17 cases (all CB and AC of CML patients and 2 out of 5 LCP samples of CML patients) and the statistical analysis by qui-square test showed correlation between this two tests. Conclusions: These results suggest that the two methods together can increase the sensibility of screening for p53 abnormalities in CML patients. The presence of abnormal SSCP associated to the p53 protein expression in advanced phases of this disease in the most of cases, suggesting that these tests can be used as an indicator of progression of CML.

Análise Multifatorial dos Mecanismos de Resistência ao Tratamento em Linhagens Celulares Derivadas do Linfoma de Burkitt

O Linfoma de Burkitt (LB) é o linfoma maligno mais comum da infância. Embora o regime de tratamento utilizado atualmente seja bem sucedido em grande parte dos casos, há uma constante busca por regimes menos tóxicos, e terapêutica de resgate para os pacientes refratários ao tratamento inicial, ou que apresentam recidiva. Nesse sentido, o entendimento dos mecanismos moleculares de resistência e refratariedade ao tratamento podem auxiliar na obtenção de um modelo de terapia eficaz no caso de falha ao tratamento inicial. Uma importante via de atuação de diversos agentes quimioterápicos, incluindo aqueles usados no tratamento do LB, é a de indução de apoptose mediada pela proteína p53. O gene TP53 encontra-se mutado em uma grande proporção de tumores humanos, e já foi mostrado que suas mutações correlacionam-se com a resposta ao tratamento em diversos tipos tumorais. No entanto, alguns estudos têm demonstrado que diferentes tipos de mutações podem conferir respostas diferentes das células à quimioterapia. Nesse estudo utilizamos duas linhagens celulares tumorais derivadas do Linfoma de Burkitt – Daudi e Raji – que apresentam mutações distintas do gene TP53 e correlacionamos a resposta dessas células à indução de morte pela exposição aos agentes citotóxicos doxorrubicina, etoposídeo, cisplatina e radiação gama. Avaliamos também a capacidade desses agentes induzirem aumento de expressão da proteína p53 nessas linhagens, assim como, a funcionalidade das diferentes mutantes da p53 em relação à indução de apoptose, parada do ciclo celular e habilidade de transativação do gene p21. Os níveis de survivina, uma importante proteína envolvida no processo apoptótico que está sob regulação direta da p53, e da proteína pró-apoptótica SMAC/Diablo também foram avaliados antes e após a exposição das linhagens aos agentes citotóxicos. Como resultados observamos variação no percentual de apoptose, que atingiu 60-80% na Raji e 20-30% na Daudi em 48 horas com a mesma concentração de radiação ionizante. Além disso, a DL50 para os quimioterápicos foi diferente entre as duas linhagens, sendo consideravelmente maior na Daudi do que na Raji. A resistência das linhagens aos variados agentes dependeu em grande parte do tipo de mutação do gene TP53 e do agente utilizado. Observamos ainda diferenças no status funcional da proteína p53, em relação a indução de apoptose e transativação de genes alvo, como o gene p21, mostrando que diferentes mutações podem levar a conseqüências funcionais diversas. A expressão da survivina foi regulada positivamente pela p53 mutada após a exposição às drogas e à radiação gama, mostrando um papel para essa proteína na apoptose dependente de p53 e resistência...

Burkitt’s Lymphoma (BL) is the most common malignant lymphoma in children. Although the currently used treatment regimens are successful in most cases, new less toxic regimens and rescue therapeutics for patients with refractory disease, or who presented relapse are still in continuous search. In this context, understanding the molecular mechanisms related to chemotherapy resistance and lack of treatment response may help to design new treatment approaches, which could be effective in this clinical setting. An important mechanism of action of several chemotherapeutic agents, including those used in BL treatment, is the p53-mediated apoptosis induction pathway. TP53 gene is mutated in a large number of human tumors, and a relationship between p53 mutations and treatment response in many kinds of tumors has been shown. In addition, some studies have reported that different types of TP53 mutations confer different cell responses to chemotherapy. In this study we analysed two Burkitt’s Lymphoma cell lines – Daudi and Raji – in which distinct mutations of TP53 gene were previously described. Cell lines response to doxorubicin, etoposide, cisplatin, and gamma radiation-induced cell death were correlated to TP53 mutations. We also evaluated the ability of these agents to induce overexpression of p53 protein, as well as the functionality of different p53 mutants in relation to apoptosis induction, cell cycle arrest, and capacity to transactivate p21WAF1/Cip1gene. The levels of expression of survivin, an important protein (under direct regulation by p53) involved in the apoptotic process and the expression of SMAC/Diablo (a pro-apoptotic protein) were evaluated before and after cell lines exposure to the cytotoxic agents. As result, we observed differences in the apoptosis index, which reached approximately 60-80% in Raji and 20-30% in Daudi cells, 48 hours after exposure to the same concentration of gamma radiation. Besides, the chemotherapeutic LD50 (lethal dose, 50%) was different between the cell lines, being higher in Daudi when compared to Raji cell line. The resistance to varying types agents in those cell lines depended largely on the type of TP53 gene mutation and the agent used. We also observed dissimilarities in the functional status of p53 protein, regarding apoptosis induction and transactivation of target genes, such as p21, suggesting that those mutations are able to lead to distinct functional consequences. Survivin expression was upregulated by mutated p53 after exposure to drugs and gamma radiation suggesting a possible role played by this protein in p53-dependent apoptosis pathway and resistance...

Chromosome 17 abnormalities and mutation of the TP53 gene: correlation between cytogenetics, flow cytometry and molecular analysis in three cases of chronic myeloid leukemia

Alterations involving the short arm of chromosome 17 (17p) during the progression of chronic myeloid leukemia (CML) have been described. This chromosomal region contains the tumor suppressor gene TP53 that may be an important factor in the evolution of this disease. In this study, we used flow cytometry and western blotting to assess p53 protein expression and single stranded conformational polymorphism to examine TP53 gene alterations in three patients with CML who showed alterations in 17p. Only the case with del(17)(p11) had p53 expression positive by flow cytometry and an abnormal migration pattern by SSCP analysis. The importance of the correlation between the results obtained with these techniques, as well as the clinical course of the patients, are discussed.